信號弱
如果抗體染色信號弱或無信號,可能是由于以下原因引起的:
1、抗體儲存
確保你的抗體保存在4℃并且避光。如果抗體結(jié)合了熒光素,那么千萬不要冷凍保存,因?yàn)檫@可能會導(dǎo)致熒光抗體的沉淀和聚集。還有,要確??贵w沒有過期。
2、稀釋
你是不是一直在用廠家推薦的量做實(shí)驗(yàn)?你可能需要進(jìn)行抗體滴定找到最佳抗體用量。
詳見:
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html
3、儀器--濾光片設(shè)置
確保流式機(jī)器配置有合適的、能夠檢測到你所用熒光的激光和濾光片。例如Brilliant Violet? 570需要紫光激光器和585/42的濾光片,如果你用了525/50濾光片,那么就檢測不到信號了。
不同熒光有不同的發(fā)射譜,為了檢測到信號,需要配置有能夠捕捉到該波長信號的濾光片。在上面的例子中,525/50濾光片只能捕捉500~550nm的信號,而BV570的峰值波長在570nm,超出了范圍,故無法被該濾光片檢測到。
還有需要了解每根激光有多少個(gè)光電倍增管(PMT),如果紫光激光器只有3個(gè)PMT,那么你想檢測4色就不可能了。
4、儀器--激光性能
如果流式細(xì)胞儀的激光沒有很好的校準(zhǔn),那么就可能導(dǎo)致某些通道(或所有通道)信號弱。使用一些校準(zhǔn)微球可以很方便地檢查儀器性能。所以記得按照流式細(xì)胞儀廠家的指導(dǎo)定期進(jìn)行質(zhì)量控制和優(yōu)化檢查。
5、抗原表達(dá)--表達(dá)密度
某些抗原本身就表達(dá)非常弱,或者只有非常少的細(xì)胞群體表達(dá),此時(shí),表達(dá)弱就是正常的??梢試L試選擇強(qiáng)的熒光素或選擇SI值高的抗體(參見:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html)
6、抗原表達(dá)--細(xì)胞特異性
有些單倍型特異性標(biāo)記只表達(dá)在某些系別的小鼠上,所以購買抗體前需要詳細(xì)閱讀抗體說明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。
而且,流式細(xì)胞術(shù)基于逐級設(shè)門,如果門一開始設(shè)錯(cuò)了,也可能影響最后的分析結(jié)果,導(dǎo)致假性弱表達(dá)。
7、抗原表達(dá)--表達(dá)位置
要知道,有些抗原表達(dá)在細(xì)胞表面、有些表達(dá)在胞漿、細(xì)胞器內(nèi)、胞核,甚至有些所有部位都表達(dá)。所以需要采用合適的方法學(xué)去檢測。
8、抗原表達(dá)--誘導(dǎo)
有些抗原在活化后發(fā)生下調(diào),而有些標(biāo)記和細(xì)胞因子則需要誘導(dǎo)才能表達(dá)(參見:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html),如果你不經(jīng)過誘導(dǎo)就檢測這些標(biāo)記或細(xì)胞因子,就會出問題。
9、緩沖液
你實(shí)驗(yàn)使用的緩沖液是否正確?例如Biolegend的FoxP3在他們自家的foxP3緩沖液中性能良好,但如果換了其它家的緩沖液,可能就檢測不出來了。同樣,其它廠家大多也是如此。固定和破膜緩沖液也十分重要。
10、二抗
如果你一抗用了純化或生物素標(biāo)記的抗體,那么二抗是否用了正確的抗體?例如一抗用了Rat Anti-mouse,那么你的二抗應(yīng)該用Goat Anti-Rat,同時(shí)應(yīng)該用只加二抗的管子作為空白對照檢測背景熒光。
還有,你應(yīng)該檢測一下二抗是否還會跟其它一抗發(fā)生反應(yīng),這有助于發(fā)現(xiàn)是一抗還是二抗的問題。
11、固定
你是否在染色前固定或破膜了?固定和破膜能夠改變抗原表位和抗體的相互作用,這種敏感性是抗原依賴性和克隆依賴性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)這幾個(gè)表位通常在去污劑或甲醇處理后是不穩(wěn)定的。而有些抗原位點(diǎn)則需要固定后才能與抗體結(jié)合而被檢測到,例如核內(nèi)抗原PCNA和Ki67。
此外,固定時(shí)間不能太長,否則容易導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)而影響熒光素的化學(xué)特性或增加自發(fā)熒光。
12、貼壁細(xì)胞和受體
如果你在檢測貼壁細(xì)胞,使用的是胰酶消化,那么需要注意胰酶可能會影響一些表面標(biāo)記的表達(dá)。類似的現(xiàn)象也會發(fā)生在膠原酶消化后。
13、噪音和背景信號
PMT的背景信號和噪音高也會導(dǎo)致信號弱,這可能是由于激光源的散射光、其它熒光素的滲漏或自發(fā)熒光過強(qiáng)等原因引起。
14、熒光滲漏
熒光滲漏是多色流式時(shí)檢測信號出問題最常見的問題所在。所以,正確的補(bǔ)償非常重要。
關(guān)于補(bǔ)償,請參見帖子:
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html
背景熒光強(qiáng)/非特異性染色明顯
背景熒光高(即非特異性染色明顯)可能是多種因素造成,例如熒光素、抗體、標(biāo)記方法、儀器、其它試劑或數(shù)據(jù)分析等。在此,我們對這些因素進(jìn)行一一解析,讓大家能夠充分了解背景熒光的來源,從而能夠在實(shí)驗(yàn)中針對性的去解決。
1、自發(fā)熒光
不同細(xì)胞和組織,以及培養(yǎng)基添加物,都有不同水平的自發(fā)熒光。自發(fā)熒光主要的來源包括NADH、核黃素、黃素輔酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交聯(lián)、某種生物結(jié)構(gòu)(如線粒體、溶酶體等)。粒系細(xì)胞特別容易出現(xiàn)自發(fā)熒光,因?yàn)檫@些細(xì)胞內(nèi)的蛋白和分子更容易在低波長時(shí)被激發(fā)(例如紫外、紫光和藍(lán)光),發(fā)射波長大約在500~700nm,與一些常見的熒光素(如FITC、PE)重疊。所以對這類細(xì)胞應(yīng)該記得用未染色的空白對照檢查一下自發(fā)熒光水平。
另外切記,直方圖上看不出自發(fā)熒光群,只有通過散點(diǎn)圖才能看出自發(fā)熒光群體并將它圈出,如下圖中所示FL-1(GFP)和FL-2散點(diǎn)圖查看GFP表達(dá)細(xì)胞,直方圖看到兩個(gè)峰,但無法區(qū)分自發(fā)熒光,而散點(diǎn)圖則可輕松圈出自發(fā)熒光群體(AF)。
2、稀釋
抗體用量是否合適?盡管廠家會有推薦的抗體用量,但要記得使用前進(jìn)行抗體滴定,以了解最佳用量。優(yōu)化后的抗體用量可以幫助你最大程度地減少背景熒光并提高信噪比。
3、補(bǔ)償高
如果兩個(gè)或更多的熒光素之間發(fā)射譜重疊,那么就需要調(diào)節(jié)補(bǔ)償以消除相互間的影響。不過,調(diào)節(jié)補(bǔ)償前,首先需要電壓值調(diào)節(jié)到合適的值,否則會導(dǎo)致補(bǔ)償異常增大。例如下圖中,BV510?和BV570?之間由于相互滲漏存在補(bǔ)償,如果BV570?的電壓被BV510?的電壓明顯高,那么會導(dǎo)致補(bǔ)償過大(下圖左側(cè)),如果PMT電壓調(diào)節(jié)到合適值,那么他們的補(bǔ)償就非常好調(diào)了(下圖右側(cè))。
所以,有時(shí)候你的背景熒光高很可能是由于電壓沒有調(diào)好的問題。
4、代謝活化
背景熒光增高也可能由于代謝活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A時(shí),從FMO對照中明顯看出BV421?通道基線的上升,這可能由多個(gè)因素引起,包括自發(fā)熒光增高和其它熒光素的滲漏增大引起。
5、花青素染料
花青素染料和一些相關(guān)串聯(lián)染料很容易結(jié)合到Fc受體,尤其是單核細(xì)胞。這種反應(yīng)無法通過Fc受體阻斷劑阻斷,其確切原因未知。如果你在研究髓系細(xì)胞中的一個(gè)群體,建議還是用其它類別的熒光素。
6、細(xì)胞碎片
你有沒有用活性染料來確保分析時(shí)都能分析到活細(xì)胞?細(xì)胞碎片、死細(xì)胞可導(dǎo)致高背景染色,所以在設(shè)門時(shí),切記要排除掉碎片。一般情況下,碎片在FSC/SSC散點(diǎn)圖中位于最左下方(如下圖)。
7、活性
如果分析時(shí)不小心設(shè)門將死細(xì)胞/碎片圈進(jìn)了,就可能會出現(xiàn)一些假陽性。所以用PI或7-AAD甚至一些更好的活性染料,能夠很好的排除死細(xì)胞(關(guān)于活性染料,我們之前發(fā)過一篇相關(guān)文章:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4124-1-1.html)。
DAPI也可以用來區(qū)分死/活細(xì)胞,它也能夠透過活細(xì)胞膜,但效率很低。下圖顯示了DAPI+細(xì)胞群和DAPI-細(xì)胞群之間CD45/CD11b散點(diǎn)圖的區(qū)別。
8、Fc阻斷
Fc受體表達(dá)在很多細(xì)胞表面,包括粒細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。它們很容易結(jié)合抗體的Fc部分,從而導(dǎo)致結(jié)果假陽性。為了這種背景熒光,推薦使用商品化的Fc受體阻斷劑或相應(yīng)物種的血清。
9、FMO/同型對照
同型對照是為了幫助確定目的抗體非特異性背景染色(針對Fc受體或胞內(nèi)蛋白結(jié)合)而設(shè)置的陰性對照。FMO(熒光扣從對照)相對來說在抗原表達(dá)弱、或者進(jìn)行多色流式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候更適合,它可以反映你的抗體組合中其它通道熒光的滲漏,幫助你選擇正確的陽性群體。
如果你要使用同型對照,記得一定要選擇與目的抗體相同量的同型抗體。例如你使用1ug CD4,那么就要使用1ug同型對照。
避免從不同公司購買同型和目的抗體,因?yàn)椴煌墓?,其抗體熒光素:蛋白(F:P)比例是不同的。
10、粘連體
粘連體通常發(fā)生在細(xì)胞之間粘附在一起或分裂過程中。粘連體給流式細(xì)胞術(shù)分析帶來了困難,因?yàn)檎尺B體通過檢測點(diǎn)時(shí),檢測裝置仍然認(rèn)為它是一個(gè)信號。所以如果沒有在分析時(shí)設(shè)門排除掉粘連體,那么就可能對結(jié)果造成誤讀。
在流式緩沖液中加入EDTA,并且將標(biāo)本通過30um過濾,可以使粘連體大大減少。
粘連體還可以通過散點(diǎn)圖的W/H或W/A設(shè)門排除。如下圖,(1)代表單個(gè)細(xì)胞群,(2)代表粘連體,兩種群體的結(jié)果明顯不同。
11、串聯(lián)染料降解
如果你使用的是串聯(lián)染料,那么如果抗體保存不當(dāng)或者沒有避光,那么就可能發(fā)生降解。在下圖的例子中,左圖是正常的PE-cy5檢測結(jié)果,可以看到FL2沒有信號,但PE-cy5染料在光照后降解,右側(cè)圖就可以明顯看到FL2(PE通道)也能檢測到很強(qiáng)的信號。
串聯(lián)染料對某些固定方式也很敏感,所以如果在固定后檢測發(fā)現(xiàn)背景熒光異常,那時(shí)也需要考慮是否由于固定劑引起。