信號弱

如果抗體染色信號弱或無信號，可能是由于以下原因引起的：

1、抗體儲存

確保你的抗體保存在4℃并且避光。如果抗體結(jié)合了熒光素，那么千萬不要冷凍保存，因?yàn)檫@可能會導(dǎo)致熒光抗體的沉淀和聚集。還有，要確?？贵w沒有過期。

2、稀釋

你是不是一直在用廠家推薦的量做實(shí)驗(yàn)？你可能需要進(jìn)行抗體滴定找到最佳抗體用量。

詳見：

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html

3、儀器--濾光片設(shè)置

確保流式機(jī)器配置有合適的、能夠檢測到你所用熒光的激光和濾光片。例如Brilliant Violet? 570需要紫光激光器和585/42的濾光片，如果你用了525/50濾光片，那么就檢測不到信號了。

不同熒光有不同的發(fā)射譜，為了檢測到信號，需要配置有能夠捕捉到該波長信號的濾光片。在上面的例子中，525/50濾光片只能捕捉500~550nm的信號，而BV570的峰值波長在570nm，超出了范圍，故無法被該濾光片檢測到。

還有需要了解每根激光有多少個(gè)光電倍增管（PMT），如果紫光激光器只有3個(gè)PMT，那么你想檢測4色就不可能了。

4、儀器--激光性能

如果流式細(xì)胞儀的激光沒有很好的校準(zhǔn)，那么就可能導(dǎo)致某些通道（或所有通道）信號弱。使用一些校準(zhǔn)微球可以很方便地檢查儀器性能。所以記得按照流式細(xì)胞儀廠家的指導(dǎo)定期進(jìn)行質(zhì)量控制和優(yōu)化檢查。

5、抗原表達(dá)--表達(dá)密度

某些抗原本身就表達(dá)非常弱，或者只有非常少的細(xì)胞群體表達(dá)，此時(shí)，表達(dá)弱就是正常的?？梢試L試選擇強(qiáng)的熒光素或選擇SI值高的抗體（參見：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html）

6、抗原表達(dá)--細(xì)胞特異性

有些單倍型特異性標(biāo)記只表達(dá)在某些系別的小鼠上，所以購買抗體前需要詳細(xì)閱讀抗體說明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。

而且，流式細(xì)胞術(shù)基于逐級設(shè)門，如果門一開始設(shè)錯(cuò)了，也可能影響最后的分析結(jié)果，導(dǎo)致假性弱表達(dá)。

7、抗原表達(dá)--表達(dá)位置

要知道，有些抗原表達(dá)在細(xì)胞表面、有些表達(dá)在胞漿、細(xì)胞器內(nèi)、胞核，甚至有些所有部位都表達(dá)。所以需要采用合適的方法學(xué)去檢測。

8、抗原表達(dá)--誘導(dǎo)

有些抗原在活化后發(fā)生下調(diào)，而有些標(biāo)記和細(xì)胞因子則需要誘導(dǎo)才能表達(dá)（參見：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html），如果你不經(jīng)過誘導(dǎo)就檢測這些標(biāo)記或細(xì)胞因子，就會出問題。

9、緩沖液

你實(shí)驗(yàn)使用的緩沖液是否正確？例如Biolegend的FoxP3在他們自家的foxP3緩沖液中性能良好，但如果換了其它家的緩沖液，可能就檢測不出來了。同樣，其它廠家大多也是如此。固定和破膜緩沖液也十分重要。

10、二抗

如果你一抗用了純化或生物素標(biāo)記的抗體，那么二抗是否用了正確的抗體？例如一抗用了Rat Anti-mouse，那么你的二抗應(yīng)該用Goat Anti-Rat，同時(shí)應(yīng)該用只加二抗的管子作為空白對照檢測背景熒光。

還有，你應(yīng)該檢測一下二抗是否還會跟其它一抗發(fā)生反應(yīng)，這有助于發(fā)現(xiàn)是一抗還是二抗的問題。

11、固定

你是否在染色前固定或破膜了？固定和破膜能夠改變抗原表位和抗體的相互作用，這種敏感性是抗原依賴性和克隆依賴性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)這幾個(gè)表位通常在去污劑或甲醇處理后是不穩(wěn)定的。而有些抗原位點(diǎn)則需要固定后才能與抗體結(jié)合而被檢測到，例如核內(nèi)抗原PCNA和Ki67。

此外，固定時(shí)間不能太長，否則容易導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)而影響熒光素的化學(xué)特性或增加自發(fā)熒光。

12、貼壁細(xì)胞和受體

如果你在檢測貼壁細(xì)胞，使用的是胰酶消化，那么需要注意胰酶可能會影響一些表面標(biāo)記的表達(dá)。類似的現(xiàn)象也會發(fā)生在膠原酶消化后。

13、噪音和背景信號

PMT的背景信號和噪音高也會導(dǎo)致信號弱，這可能是由于激光源的散射光、其它熒光素的滲漏或自發(fā)熒光過強(qiáng)等原因引起。

14、熒光滲漏

熒光滲漏是多色流式時(shí)檢測信號出問題最常見的問題所在。所以，正確的補(bǔ)償非常重要。

關(guān)于補(bǔ)償，請參見帖子：

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html

背景熒光強(qiáng)/非特異性染色明顯

背景熒光高（即非特異性染色明顯）可能是多種因素造成，例如熒光素、抗體、標(biāo)記方法、儀器、其它試劑或數(shù)據(jù)分析等。在此，我們對這些因素進(jìn)行一一解析，讓大家能夠充分了解背景熒光的來源，從而能夠在實(shí)驗(yàn)中針對性的去解決。

1、自發(fā)熒光

不同細(xì)胞和組織，以及培養(yǎng)基添加物，都有不同水平的自發(fā)熒光。自發(fā)熒光主要的來源包括NADH、核黃素、黃素輔酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交聯(lián)、某種生物結(jié)構(gòu)（如線粒體、溶酶體等）。粒系細(xì)胞特別容易出現(xiàn)自發(fā)熒光，因?yàn)檫@些細(xì)胞內(nèi)的蛋白和分子更容易在低波長時(shí)被激發(fā)（例如紫外、紫光和藍(lán)光），發(fā)射波長大約在500~700nm，與一些常見的熒光素（如FITC、PE）重疊。所以對這類細(xì)胞應(yīng)該記得用未染色的空白對照檢查一下自發(fā)熒光水平。

另外切記，直方圖上看不出自發(fā)熒光群，只有通過散點(diǎn)圖才能看出自發(fā)熒光群體并將它圈出，如下圖中所示FL-1（GFP）和FL-2散點(diǎn)圖查看GFP表達(dá)細(xì)胞，直方圖看到兩個(gè)峰，但無法區(qū)分自發(fā)熒光，而散點(diǎn)圖則可輕松圈出自發(fā)熒光群體（AF）。

2、稀釋

抗體用量是否合適？盡管廠家會有推薦的抗體用量，但要記得使用前進(jìn)行抗體滴定，以了解最佳用量。優(yōu)化后的抗體用量可以幫助你最大程度地減少背景熒光并提高信噪比。

3、補(bǔ)償高

如果兩個(gè)或更多的熒光素之間發(fā)射譜重疊，那么就需要調(diào)節(jié)補(bǔ)償以消除相互間的影響。不過，調(diào)節(jié)補(bǔ)償前，首先需要電壓值調(diào)節(jié)到合適的值，否則會導(dǎo)致補(bǔ)償異常增大。例如下圖中，BV510?和BV570?之間由于相互滲漏存在補(bǔ)償，如果BV570?的電壓被BV510?的電壓明顯高，那么會導(dǎo)致補(bǔ)償過大（下圖左側(cè)），如果PMT電壓調(diào)節(jié)到合適值，那么他們的補(bǔ)償就非常好調(diào)了（下圖右側(cè)）。

所以，有時(shí)候你的背景熒光高很可能是由于電壓沒有調(diào)好的問題。

4、代謝活化

背景熒光增高也可能由于代謝活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A時(shí)，從FMO對照中明顯看出BV421?通道基線的上升，這可能由多個(gè)因素引起，包括自發(fā)熒光增高和其它熒光素的滲漏增大引起。

5、花青素染料

花青素染料和一些相關(guān)串聯(lián)染料很容易結(jié)合到Fc受體，尤其是單核細(xì)胞。這種反應(yīng)無法通過Fc受體阻斷劑阻斷，其確切原因未知。如果你在研究髓系細(xì)胞中的一個(gè)群體，建議還是用其它類別的熒光素。

6、細(xì)胞碎片

你有沒有用活性染料來確保分析時(shí)都能分析到活細(xì)胞？細(xì)胞碎片、死細(xì)胞可導(dǎo)致高背景染色，所以在設(shè)門時(shí)，切記要排除掉碎片。一般情況下，碎片在FSC/SSC散點(diǎn)圖中位于最左下方（如下圖）。

7、活性

如果分析時(shí)不小心設(shè)門將死細(xì)胞/碎片圈進(jìn)了，就可能會出現(xiàn)一些假陽性。所以用PI或7-AAD甚至一些更好的活性染料，能夠很好的排除死細(xì)胞（關(guān)于活性染料，我們之前發(fā)過一篇相關(guān)文章：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4124-1-1.html）。

DAPI也可以用來區(qū)分死/活細(xì)胞，它也能夠透過活細(xì)胞膜，但效率很低。下圖顯示了DAPI+細(xì)胞群和DAPI-細(xì)胞群之間CD45/CD11b散點(diǎn)圖的區(qū)別。

8、Fc阻斷

Fc受體表達(dá)在很多細(xì)胞表面，包括粒細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。它們很容易結(jié)合抗體的Fc部分，從而導(dǎo)致結(jié)果假陽性。為了這種背景熒光，推薦使用商品化的Fc受體阻斷劑或相應(yīng)物種的血清。

9、FMO/同型對照

同型對照是為了幫助確定目的抗體非特異性背景染色（針對Fc受體或胞內(nèi)蛋白結(jié)合）而設(shè)置的陰性對照。FMO（熒光扣從對照）相對來說在抗原表達(dá)弱、或者進(jìn)行多色流式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候更適合，它可以反映你的抗體組合中其它通道熒光的滲漏，幫助你選擇正確的陽性群體。

如果你要使用同型對照，記得一定要選擇與目的抗體相同量的同型抗體。例如你使用1ug CD4，那么就要使用1ug同型對照。

避免從不同公司購買同型和目的抗體，因?yàn)椴煌墓?，其抗體熒光素：蛋白（F：P）比例是不同的。

10、粘連體

粘連體通常發(fā)生在細(xì)胞之間粘附在一起或分裂過程中。粘連體給流式細(xì)胞術(shù)分析帶來了困難，因?yàn)檎尺B體通過檢測點(diǎn)時(shí)，檢測裝置仍然認(rèn)為它是一個(gè)信號。所以如果沒有在分析時(shí)設(shè)門排除掉粘連體，那么就可能對結(jié)果造成誤讀。

在流式緩沖液中加入EDTA，并且將標(biāo)本通過30um過濾，可以使粘連體大大減少。

粘連體還可以通過散點(diǎn)圖的W/H或W/A設(shè)門排除。如下圖，（1）代表單個(gè)細(xì)胞群，（2）代表粘連體，兩種群體的結(jié)果明顯不同。

11、串聯(lián)染料降解

如果你使用的是串聯(lián)染料，那么如果抗體保存不當(dāng)或者沒有避光，那么就可能發(fā)生降解。在下圖的例子中，左圖是正常的PE-cy5檢測結(jié)果，可以看到FL2沒有信號，但PE-cy5染料在光照后降解，右側(cè)圖就可以明顯看到FL2（PE通道）也能檢測到很強(qiáng)的信號。

串聯(lián)染料對某些固定方式也很敏感，所以如果在固定后檢測發(fā)現(xiàn)背景熒光異常，那時(shí)也需要考慮是否由于固定劑引起。